GLP-1(enllaç:https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/peptide/glp-1-peptide-cas-87805-34-3.html) és una hormona polipeptídica formada per 30 aminoàcids. Amb la investigació en profunditat sobre GLP-1, s'han desenvolupat cada cop més mètodes sintètics. Aquest article introduirà sistemàticament els mètodes de síntesi actuals de GLP-1.
Mètode 1, síntesi en fase sòlida:
La síntesi en fase sòlida és un mètode àmpliament utilitzat per a la síntesi de pèptids i proteïnes, i també s'utilitza habitualment per a la síntesi de GLP-1. En la síntesi en fase sòlida, l'estructura central es forma unint el primer aminoàcid a la resina. A continuació, s'afegeix el següent aminoàcid en seqüència i es fa reaccionar químicament amb un agent de condensació adequat. Finalment, el producte objectiu es pot obtenir escindant el polipèptid de la resina.
La importància de la síntesi en fase sòlida és que permet l'automatització i la producció a gran escala de la síntesi de pèptids. Els mètodes de síntesi en fase sòlida principals actuals inclouen Fmoc i Boc. Entre ells, el mètode Fmoc utilitza el grup protector N-Fmoc per protegir el pèptid, mentre que el mètode Boc utilitza tert-butiloxicarbonil per protegir el grup carboxil.
Mètode dos, síntesi en fase líquida:
La síntesi en fase líquida és un mètode tradicional de síntesi de pèptids en què els reactius es col·loquen a la fase líquida per a la reacció. L'avantatge de la síntesi en fase líquida és que les condicions de reacció són suaus i adequades per a la modificació d'estructures químiques sensibles. Tanmateix, a causa de massa reactius, el procés de purificació és relativament feixuc. Les reaccions químiques en la síntesi en fase líquida inclouen:
1. Reacció de condensació:
La reacció de condensació és una de les reaccions més bàsiques en la síntesi de pèptids, és a dir, el grup carboxil iniciat per agents de condensació com DCC i HOBt està connectat al grup amino de l'aminoàcid mitjançant la reacció d'acilació. Les condicions de reacció són suaus i el rendiment és alt.
2. Reaccions d'eliminació:
La reacció d'eliminació consisteix a reduir la metionina al ditiol per NaBH4 i altres agents reductors, fent-la inactiva. La reacció s'ha de dur a terme en condicions bàsiques.
3. Eliminació de grups protectors:
A causa de les diferents funcions dels aminoàcids a la cadena peptídica, s'utilitzaran diferents grups protectors per a la protecció. Un cop finalitzada la síntesi, cal eliminar el grup protector. Per al mètode Fmoc, normalment s'utilitza piperidina per eliminar Fmoc; mentre que per al mètode Boc, s'utilitza TFA per eliminar Boc.
Mètode tres, síntesi química:
El GLP-1 és una hormona polipeptídica amb activitats biològiques importants. La seva síntesi es pot realitzar mitjançant diversos mètodes, entre els quals la síntesi química és un dels mètodes més utilitzats. L'avantatge de la síntesi química és que pot produir productes objectiu altament purs, adequats per a la producció a gran escala. El mètode de síntesi química i els passos detallats de GLP-1 s'introduiran a continuació.
1. Selecció de ruta sintètica i grup protector:
La molècula GLP-1 consta de 36 aminoàcids, inclosos 21 aminoàcids de tipus L i 15 aminoàcids de tipus D. Abans de realitzar la síntesi, cal seleccionar una ruta sintètica adequada i seleccionar el grup protector corresponent segons les condicions de síntesi. La síntesi en fase sòlida Fmoc s'utilitza normalment per a la síntesi automatitzada a gran escala. Aquest mètode utilitza la protecció de N-9-fluoroimido carboxil (N-Fmoc) com a grup protector i també ha de seleccionar un grup protector secundari adequat (com ara terc-butil o metil) per garantir la protecció de llocs específics. Cada vegada que s'afegeix un nou aminoàcid, primer s'ha d'eliminar el grup protector Fmoc i després s'afegeix la substància d'acoblament protegida del següent aminoàcid.
2. Síntesi de la seqüència d'aminoàcids bàsics:
La seqüència bàsica de GLP-1 consta de 21 aminoàcids, incloent una seqüència clau de serina i quatre seqüències dipeptídiques d'àcid prolil-glutàmic. En la síntesi en fase sòlida, la síntesi de la seqüència central es pot dividir en els passos següents:
2.1. Afegiu carbamat d'àcid acètic (Fmoc-NH-CH2CO2Et) i 2-Cl-Trt-Cl a la resina sintètica en fase sòlida i realitzeu la reacció de condensació amb l'agent d'acoblament DIC/NMM.
2.2. Elimineu el grup protector Fmoc mitjançant la reacció de desprotecció del grup.
2.3. Afegiu el següent aminoàcid, repeteix el pas 1 i el pas 2 en seqüència fins que es sintetitza la seqüència central.
2.4. Formació d'estructures pentapeptídiques sobre resina en fase sòlida. Afegiu el reactiu d'acetalització a la resina en fase sòlida, reaccioneu amb l'agent de reconeixement N-terminal (com ara HBTU), afegiu el grup de protecció de la cadena lateral de serina com a agent reductor auxiliar i, a continuació, elimineu el grup de protecció Fmoc.
2.5. Sota la catàlisi de la transferasa de Bacillus subtilis (ProTide), l'estructura del pentapèptid experimenta una reacció d'intercanvi amb el precursor del iodoacetat de serina.
3. Síntesi de la seqüència d'aminoàcids restants:
Després de completar la síntesi de la seqüència central, cal continuar afegint els aminoàcids restants, inclosos els aminoàcids de tipus L i D. L'addició d'aquests aminoàcids ha de començar des de la seqüència central, afegir el següent aminoàcid en seqüència i utilitzar l'agent de condensació corresponent per dur a terme reaccions químiques fins que es sintetitza una molècula polipeptídica GLP-1 completa. Durant aquest procés, també cal seleccionar un grup protector adequat segons sigui necessari i realitzar els passos de reacció, eliminació del grup protector i addició d'aminoàcids en seqüència.
4. Tractament amb hidròxid de sodi:
Després d'haver afegit tots els aminoàcids, es forma una cadena peptídica incompletament sintetitzada a la resina en fase sòlida i s'ha de processar per formar una molècula peptídica totalment formada. En primer lloc, el pèptid no format s'ha d'hidrolitzar per hidròxid de sodi, de manera que el grup carboxil C-terminal originalment unit a la resina es desenganxi de la resina i el grup protector es desenganxi a l'aigua. Després de la reacció d'hidròlisi, s'obté el producte objectiu.
5. Precipitació i rentat:
Després del tractament, la solució hidrolitzada es tracta amb àcid per precipitar el producte objectiu. A continuació, es va tornar a suspendre el pellet en aigua, seguit d'un rentat intensiu per eliminar les impureses.
6. Purificació:
El pas final és la purificació del producte desitjat, normalment mitjançant cromatografia líquida d'alt rendiment. Durant aquest procés, la puresa del producte es pot determinar detectant el pic de la solució en l'espectre de masses. En resum, la síntesi química de GLP-1 requereix diverses rondes de reaccions complexes i processos de purificació estrictes per obtenir finalment el producte objectiu actiu.
Mètode quatre, biosíntesi:
El GLP-1 és una hormona polipeptídica important amb diversos efectes fisiològics, com ara la promoció de la secreció d'insulina, la supressió de la gana, la reducció del pes corporal i el manteniment de la sensibilitat a la insulina, etc. El mètode de biosíntesi de GLP-1 es sintetitza principalment per cèl·lules L. a la glàndula pancreàtica, i la seva taxa de síntesi es regula amb la ingesta dietètica. Els passos detallats s'introdueixen de la següent manera:
1. Treball preparatori abans de la síntesi:
Abans de la biosíntesi de GLP-1, cal fer un treball preparatori, com ara determinar el tipus de cèl·lula utilitzat, establir les condicions de cultiu i seleccionar l'enzim catalític adequat. Les cèl·lules L són la principal font de síntesi de GLP-1 perquè contenen precursors de dues hormones, GIP (pèptid semblant al glucagó 1) i GLP-1. Les cèl·lules L es poden aïllar de l'epiteli intestinal de conills o ratolins. Abans de la biosíntesi, les cèl·lules s'han de cultivar en un nombre suficient, i s'han de proporcionar suficients nutrients i condicions de cultiu adequades. A més, cal seleccionar l'enzim catalític adequat per afavorir la reacció.
2. Síntesi i processament de precursors:
La biosíntesi de GLP-1 es produeix principalment a les cèl·lules L, i el seu precursor està format per dues hormones, GIP i GLP-1. Després d'entrar a les cèl·lules endocrines, GIP i GLP-1 són processats per enzims proteolítics i escindits en pèptids individuals. Una sèrie d'enzims i cofactors estan implicats en aquest procés, incloent el precursor de la polipèptid acidasa (PC2), la isomerasa i els factors d'adhesió tardana.
3. Conversió mútua entre segments polipeptídics:
Després del processament, els pèptids GIP i GLP-1 es recombinen per formar el polipèptid GLP-1. Aquest procés requereix l'ús del pèptid 1 semblant al glucagó (GLP-1) com a plantilla a la qual es combinen altres pèptids individuals per formar nous polipèptids compostos. Aquest procés també requereix alguns enzims i factors específics, com ara Prohormone Convertasa 1/3 (PC1/3) i Carboxipeptidasa E (CPE).
4. Secreció de GLP-1:
Un cop sintetitzat i processat el GLP-1, s'emmagatzema al citoplasma i a les vesícules internes de les cèl·lules endocrines. Quan són estimulades per la dieta, les cèl·lules endocrines alliberen GLP-1 i entren a la circulació sanguínia a través dels microvasos. Aquest procés es regula i controla a través d'una sèrie de vies de transducció del senyal, inclosa la cAMP-Ca2 mésetcètera.
En resum, la biosíntesi de GLP-1 implica l'acció conjunta de múltiples enllaços i factors. La combinació de biosíntesi i síntesi química pot proporcionar una millor base i suport per a la investigació i la producció de GLP-1.
Mètode 5, síntesi enzimàtica:
La síntesi enzimàtica és la síntesi de cadenes peptídiques mitjançant la catàlisi d'enzims biològics. En comparació amb els mètodes tradicionals de síntesi en fase líquida, la síntesi enzimàtica es pot dur a terme a temperatura ambient i es pot seleccionar una àmplia gamma de matèries primeres. Normalment s'utilitzen enzims com la teta-líquid sintasa, AEP, ACE, etc. per catalitzar la síntesi.
En conclusió, els mètodes esmentats anteriorment són mètodes factibles per a la síntesi de GLP-1. Els diferents mètodes són adequats per a diferents condicions experimentals i entorns de producció farmacèutica.