Estreptavidina Sigma CAS 9013-20-1

1. Coneix l'estreptavidina
L'estreptavidina (SA), una proteïna secretada derivada de Streptomyces avidinii, té un pes molecular d'aproximadament 65-66 kDa i un punt isoelèctric d'uns 6,0. És una proteïna tetràmer formada per quatre subunitats homòlogues, cadascuna amb un lloc d'unió de biotina independent, el que significa que una molècula d'estreptavidina es pot unir simultàniament a quatre molècules de biotina. La constant de dissociació (Kd) entre els dos és tan baixa com uns 10 ⁻¹⁵ M, que és una de les interaccions biològiques no covalents més fortes conegudes i es pot considerar com el "mecanisme de bloqueig molecular" més precís de la natura.

En comparació amb l'avidina derivada de la clara d'ou, té avantatges incomparables:

No conté modificacions de la glicosilació, és en general neutre elèctricament, per tant té una unió no específica-extremadament baixa en condicions fisiològiques, un fons experimental net i una relació senyal-a-excel·lent. A més, la seva excel·lent resistència a la desnaturalització i la degradació de la proteasa, així com la seva capacitat de suportar pH extrems, altes temperatures (70-80 graus C), dissolvents orgànics i agents desnaturalitzants convencionals (com SDS i urea), han substituït l'avidina i s'han convertit en el "estàndard d'or" indiscutible en els sistemes d'unió de biotina.

És precisament amb aquestes característiques destacades que brilla en camps com les ciències de la vida, el diagnòstic in vitro, el cribratge de fàrmacs i la biodetecció.

2. Proves immunitàries
L'aplicació en el camp de la detecció immune és la seva aplicació més clàssica i àmpliament utilitzada. Des del seu desenvolupament a finals de la dècada de 1970, el sistema de biotina estreptavidina (BAS) s'ha convertit en la pedra angular de l'etiquetatge immune i l'anàlisi de traçat a causa de la seva afinitat ultra-i l'efecte d'amplificació en cascada. Segons les estadístiques, al voltant del 85% dels analitzadors de quimioluminiscència comuns utilitzen mètodes de detecció basats en BAS, que indiquen la seva posició dominant.

2.1 Assaig immunoabsorbent lligat a enzims (ELISA)

En ELISA, la peroxidasa de rave picant (HRP) o la fosfatasa alcalina (AP) es poden acoblar i l'enzim es pot guiar amb precisió a l'objectiu mitjançant anticossos biotinilats. HRP catalitza substrats luminiscents TMB, DAB o ECL per produir senyals químics o òptics potents, mentre que AP catalitza BCIP/NBT, PNPP i altres substrats per produir senyals estables de color o quimioluminescència. Una molècula diana biotinilada pot unir-se a estreptavidina marcada múltiple, aconseguint una amplificació del senyal multi-nivell i fent possible la detecció d'objectius de baixa abundància. Aquesta tecnologia s'utilitza àmpliament en ELISA sandvitx i competitiu, abastant escenaris com la quantificació de proteïnes, detecció d'anticossos, cribratge de patògens, etc.

2.2 Immunoblotting de proteïnes (Western Blot)
En Western Blot, la unió amb anticossos secundaris biotinilats pot millorar significativament la intensitat del senyal de les proteïnes diana a les pel·lícules de transferència. En comparació amb els sistemes d'anticossos secundaris tradicionals, els sistemes BAS poden aconseguir una amplificació del senyal més forta a causa de les seves propietats d'unió tetravalent. A més, a causa de la baixa unió no específica-de l'estreptavidina, la interferència de fons es redueix significativament, cosa que les fa especialment adequades per a l'anàlisi quantitativa de proteïnes d'abundància baixa.

2.3 Immunohistoquímica (IHC) i Immunocitoquímica (ICC)
L'estreptavidina marcada amb HRP o marcada AP és l'eina d'amplificació del senyal preferida per a IHC i ICC. El sistema HRP és adequat per a experiments que requereixen una sensibilitat de detecció extremadament alta, mentre que el sistema AP és especialment adequat per a sistemes que contenen inhibidors de HRP (com ara l'azida de sodi) o escenaris experimentals que requereixen un desenvolupament de color a llarg termini i una estabilitat del senyal. En unir sondes o anticossos biotinilats als conjugats d'estreptavidina, les molècules diana es poden localitzar amb precisió en seccions de teixit o mostres cel·lulars.

2.4 Immunofluorescència (IF) i hibridació in situ (ISH)

L'estreptavidina marcada amb fluoresceïna (com FITC Streptavidin, PE Streptavidin, APC Streptavidin) és una eina de visualització universal per a la tinció d'immunofluorescència i la hibridació in situ. El marcador FITC té una longitud d'ona d'excitació/emissió d'aproximadament 494/519 nm i presenta una fluorescència verda brillant; La longitud d'ona d'excitació/emissió del marcador PE és d'uns 565/578 nm, que és el "estàndard d'or" per a l'anàlisi de citometria de flux multi-color; El marcador APC cobreix l'espectre vermell llunyà, facilitant la imatge multi-color. Aquests marcadors fluorescents es poden unir amb precisió a anticossos biotinilats o sondes d'àcid nucleic per aconseguir l'anàlisi de localització i la detecció quantitativa de les molècules diana.

2.5 Citometria de flux (FACS)

En citometria de flux, s'utilitza estreptavidina marcada fluorescentment (especialment marcada amb PE) per detectar antígens de superfície cel·lular marcats amb anticossos biotinilats. La seva excel·lent brillantor proporciona una relació senyal-a-soroll extremadament alta, que pot detectar eficaçment poblacions cel·lulars amb una expressió d'antigen de superfície baixa o senyals febles. És un reactiu indispensable en l'anàlisi de citometria de flux multi-color.

2.6 Assaig immunospot vinculat a enzims (ELISPOT)
L'estreptavidina marcada amb AP presenta un rendiment excel·lent a ELISPOT i és adequada per a l'anàlisi en fase sòlida-i sistemes de tinció de teixits i cèl·lules. Pot catalitzar de manera estable la producció de substrats de senyals puntuals comptables per a la detecció de secreció de citocines a nivell d'un sol -cel·lular.

3. Purificació de proteïnes i àcids nucleics
3.1 Cromatografia d'afinitat i purificació de proteïnes
L'estreptomicina és el component bàsic de l'embalatge de la cromatografia d'afinitat. Després d'etiquetar la proteïna que s'ha de purificar amb biotina, es barreja amb gel d'agarosa d'estreptavidina (com ara Streptavidin Agarose/Sepharose) i la proteïna marcada s'unirà estretament a l'estreptavidina del farcit. Rentant per eliminar les impureses i després rentar la proteïna objectiu en condicions adequades (com ara tampó SDS-PAGE bullint, tractament SDS al 0,1% o tractament amb formamida+10 mM EDTA al 95% a pH 8,2), es poden obtenir productes d'alta -puresa.

Prenent com a exemple la producció industrial d'insulina humana recombinant, les perles magnètiques d'estreptavidina d'alta -qualitat poden unir més de 1.200 pmol de biotina lliure per mil·ligram, i la puresa de la proteïna purificada pot arribar al 95%.

3.2 Immunoprecipitació (IP) i immunoprecipitació de cromatina (ChIP)
L'aplicació de perles magnètiques d'estreptavidina en la immunoprecipitació millora molt l'eficiència experimental. Els investigadors poden fixar anticossos biotinilats a les perles magnètiques d'estreptavidina i incubar-les amb el lisat cel·lular.

Els anticossos capturen específicament la proteïna diana i les seves proteïnes que interactuen, formant un complex de "proteïna diana d'anticossos de perles magnètiques". Es pot separar ràpidament sota l'acció d'un camp magnètic extern, amb un funcionament senzill i alta sensibilitat. En els experiments ChIP, també es van utilitzar perles magnètiques d'estreptavidina per capturar complexos de proteïnes d'ADN biotinilats i estudiar la interacció entre proteïnes i ADN.

3.3 Experiment desplegable
En l'estudi de les interaccions entre proteïnes-proteïnes, les perles magnètiques poden capturar proteïnes d'esquer biotinilades i després "peixos" per a les preproteïnes que interaccionen amb elles. Per exemple, quan s'estudien vies de senyalització clau a les cèl·lules tumorals, els anticossos específics que reconeixen la proteïna P53 s'immobilitzen en perles magnètiques d'estreptavidina i s'incuben amb el lisat de cèl·lules tumorals per enriquir eficaçment P53 i les seves proteïnes associades. En comparació amb els mètodes tradicionals d'immunoprecipitació, la perla magnètica IP té una major sensibilitat i especificitat i pot enriquir de manera més eficaç les proteïnes diana de baixa abundància.

3.4 ARN Tire-avall
Les perles magnètiques també són adequades per a experiments de tirada-d'ARN. Després d'unir-se amb perles magnètiques d'estreptavidina, les sondes d'ARN biotinilats poden capturar proteïnes que interaccionen amb l'ARN dels lisats cel·lulars per estudiar les xarxes d'interacció de proteïnes d'ARN.
3.5 Preparació d'ADN monocatenari i extracció d'àcids nucleics
Es pot unir amb oligonucleòtids biotinilats per a la preparació d'ADN monocatenari i l'extracció eficient d'àcids nucleics, jugant un paper important en la clonació molecular i l'enginyeria genètica.

4. Detecció d'alt rendiment i detecció de drogues
4.1. Plataforma de proves TR-FRET
Es pot acoblar amb quelats luminescents com ara quelats d'europi per realitzar l'enllaç del senyal i la captura molecular en el sistema de detecció TR-FRET (transferència d'energia de ressonància de fluorescència resolta en temps-). Per exemple, THUNDER ™ L'estreptavidina marcada amb europi dissenyada específicament per a la plataforma experimental TR-FRET pot unir-se de manera estable a diverses molècules modificades biotinilades i s'utilitza àmpliament en l'anàlisi d'interaccions de proteïnes i el cribratge preliminar de fàrmacs diana.

Aquest sistema és homogeni i{0}}de gran rendiment, la qual cosa el converteix en una eina potent per al desenvolupament de fàrmacs moderns.

4.2 Lliurament de fàrmacs dirigit
Les seves propietats d'unió a la biotina el converteixen en un portador ideal per als sistemes de lliurament dirigits a fàrmacs. Acoblant molècules de fàrmacs amb biotina i utilitzant la capacitat d'unió dirigida de l'estreptavidina, es pot aconseguir un lliurament precís de fàrmacs, millorant l'eficiència del tractament i reduint els efectes secundaris.

4.3 Biosensors i bioxips

És el material bàsic per a la producció de biosensors i bioxips. En immobilitzar l'estreptavidina a la superfície del xip com a element de captura, es poden immobilitzar sondes de proteïnes marcades amb biotina o anticossos, aconseguint un alt-rendiment i una detecció d'alta-sensibilitat. Per exemple, en els primers xips de proteïnes de cribratge per a malalties cardiovasculars, les perles magnètiques d'estreptavidina es fixen al substrat del xip i s'utilitzen per unir sondes de proteïnes biotinilades. Això pot detectar amb precisió anomalies en pacients en les primeres etapes de la malaltia i quan les concentracions de marcadors sanguinis són tan baixes com cTnI de 0,01 ng/ml, avançant la finestra de diagnòstic en 2-3 hores en comparació amb els mètodes de diagnòstic tradicionals.

5. Biologia cel·lular i imatge
5.1 Etiquetatge de la superfície cel·lular i classificació de cèl·lules fluorescents
L'estreptavidina marcada fluorescent (com ara Vari Fluor 488 Streptavidin) s'utilitza àmpliament per a l'etiquetatge de la superfície cel·lular i la classificació de cèl·lules fluorescents. El seu espectre d'emissió cobreix tot l'espectre de llum visible i de l'infraroig proper-, i en experiments d'etiquetatge multi-color, pot entrar fàcilment al nucli i a l'estructura citoplasmàtica, etiquetar proteïnes diana per a la imatge i l'anàlisi.

5.2 Nanotecnologia i autoassemblatge de materials
Les seves propietats d'unió tetravalent el converteixen en un "pont" ideal per a l'auto{0}}assemblatge de nanomaterials. Mitjançant la unió dirigida de l'estreptavidina de la biotina, es poden construir diverses nanoestructures per a la investigació interdisciplinària, com ara la imatge biològica i el seguiment ambiental.

6. Anticòs anti estreptavidina
Amb l'ús generalitzat del sistema de biotina d'estreptavidina, ha sorgit un problema que sovint es passa per alt: - anticossos antiestreptavidina (ASA) endògens a la mostra poden interferir amb el sistema de detecció. La investigació ha descobert que la unió d'ASA a SA en el sistema de reacció pot afectar la construcció correcta de sistemes d'anticossos antigen específics, donant lloc a una precisió compromesa dels resultats d'acoblament, detecció o diagnòstic.

Per abordar aquest repte, han sorgit kits de detecció d'anticossos antiestreptavidina, que es poden utilitzar per detectar ASA endògena en mostres de pacients i evitar la seva interferència amb el sistema BAS. Roche Custom Biotech ha desenvolupat un mutant d'estreptavidina inactiu (Streptavidin rec. inactive, poly), que es pot afegir al sistema actual sense passos addicionals per bloquejar i eliminar específicament la interferència ASA, millorant la precisió i l'especificitat del sistema de detecció.

7. Interferència de la biotina
Tot i que el sistema de biotina de l'estreptavidina és potent, s'enfronta a un repte cada cop més greu - interferència de la biotina.

Quan hi ha una alta concentració de biotina lliure a la mostra de prova, competeix amb anticossos biotinilats pel lloc d'unió de l'estreptavidina, donant lloc a resultats de detecció distorsionats.

L'administració oral de 100 mg de biotina pot conduir a una concentració plasmàtica màxima de 375-450 ng/mL; Els pacients amb esclerosi múltiple poden prendre 300 mg/dia per via oral, i els seus nivells plasmàtics de biotina poden superar els 1000 ng/mL; La ingesta diària de 500 mg de biotina pot provocar concentracions extremadament altes de biotina a la sang. En els immunoassaigs sandvitx, l'excés de biotina pot produir resultats baixos errònies; En immunoassaigs competitius, pot conduir a resultats alts erronis.

Nombrosos estudis han demostrat que la TSH, la tiroxina PTH, les proves endocrines com l'hormona adrenocorticotròpica, la prolactina, la testosterona, el cortisol, així com els marcadors tumorals i els marcadors funcionals cardíacs, es veuen afectats en diferents graus per la interferència de la biotina. La FDA ha emès successivament informació d'advertència i les directrius corresponents. Les estratègies d'afrontament inclouen: la dilució en sèrie de mostres, el canvi a mètodes no BAS, com ara la cromatografia líquida-espectrometria de masses, la nova prova després de l'eliminació de la biotina (fins a 2 hores, fins a 15 dies o fins i tot mesos) o l'ús d'eliminadors de biotina gratuïts.